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我校揭示基因编辑脱靶效应研究新奥秘

南湖网讯(记者李建英孙林)近日,我校棉花团队在《植物生物技术杂志》上发表了一篇题为“全基因组测序揭示在CRISPR/Cas9编辑的棉花植物中,缺失突变很少更多的是受体材料或/和体细胞克隆变异的内在遗传”。植物学研究院的三名博士生李建英、哈基姆和孙林是论文的合著者,金双霞教授是论文的通讯作者。

本文采用高通量测序方法评价CRISPR/Cas9系统在棉花基因编辑中的缺失效应。通过对Cas9编辑的野生型对照、阴性再生植株和阳性植株的全部基因测序,结果证明CRISPR/Cas9编辑的后代中存在数千个SNP/Indels变异。这些遗传变异源于组织培养中相同亲本或体细胞变异的后代个体之间的差异,其数量远远大于CRISPR缺失位点的数量。结果表明,CRISPR/Cas9系统在多倍体植物基因组编辑中具有很高的特异性和很低的失败率。

基因组编辑技术是当前生命科学研究的前沿领域。CRISPR/Cas9系统已应用于人类遗传疾病的治疗、实现个性化细胞治疗、开发新药、作物遗传改良等领域。CRISPR/Cas9技术依靠Cas9核酸酶在gRNA的指导下切割PAM位点上游位点3碱基处的靶脱氧核糖核酸(On-target),但也切割非靶位点(类似于sgRNA靶位点序列和PAM位点),这导致所谓的脱标签(miss target),从而导致不可控的突变。因此,CRISPR技术存在的离靶效应风险是影响CRISPR技术能否广泛应用的主要限制因素。如何正确评价和降低非目标效应是当前亟待解决的问题。已经有关于动物基因编辑中CRISPR缺失效应的系统报道,而在二倍体模式植物如拟南芥和水稻中关于植物缺失效应的报道很少,并且几乎没有检测到非靶突变。鉴于这些研究的不足,对植物误靶效应进行深入评价具有重要的理论和现实意义。

在本研究中,CRISPR/Cas9系统用于对14种Cas9编辑植物的全基因组测序,加上3个再生群体中的3种野生型植物和阴性个体植物作为对照,测序深度为35倍。结果表明,通过野生型和阴性对照的比较,Cas9编辑的每个个体的后代中发现了4188 ~ 6404和312 ~ 745的DELS单核苷酸多态性。对这些突变位点侧翼序列的进一步分析表明,它们与靶位点没有同源性,而且大多数位点缺乏PAM位点。通过研究,我们可以推断这些突变位点来源于受体材料的不同后代(同一品种的不同个体)之间的遗传差异和棉花组织培养中的大量体细胞克隆变异。接下来,在软件预测的4413个潜在缺失位点中,只有4个被检测出存在真正的缺失突变,桑格测序证实了这一点。同时,通过对受体材料JIN668和TM-1参考基因组的遗传变异分析,发现了61个因不同材料间遗传变异而产生的新缺失位点。这些结果表明,在设计sgRNA时,应重视转基因亲本基因组与参考基因组之间的遗传变异,并通过计算程序降低缺失风险。

本报告是基于棉花团队在2017年建立高效基因编辑系统的后续系列报告。这两项研究表明,该团队建立的基因编辑系统具有极高的编辑效率(平均编辑效率为85%)和高特异性,能够完全满足棉花功能基因组学的研究需求。据报道,这项研究工作得到了国家重大转基因项目和国家基本基金项目的资助。

点评者:金双霞

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